聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。

原理——DNA的半保留復(fù)制

DNA 在進(jìn)行復(fù)制的時(shí)候鏈間氫鍵斷裂，雙鏈解旋分開，每條鏈作為模板在其上合成互補(bǔ)鏈，經(jīng)過一系列酶的作用生成兩個(gè)新的DNA分子。

PCR技術(shù)步驟

變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。

在其上合成互補(bǔ)鏈，經(jīng)過一系列酶的作用生成兩個(gè)新的DNA分子。

PCR模板

   PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。

PCR引物設(shè)計(jì)

    PCR引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。

（1）引物設(shè)計(jì)的基本原則引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

（2）引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.0 （自動(dòng)搜索）vOligo6 （引物評(píng)價(jià)）vVector NTI SuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3 （在線服務(wù)）

dNTPs

    dNTPs（核苷酸）由四個(gè)基本核苷酸組成。

緩沖體系

    PCR buffer能夠?yàn)镈NA聚合酶活性提供適宜的化學(xué)環(huán)境。緩沖液pH通常為8.0-9.5，一般使用Tris-HCl來調(diào)節(jié)。鎂離子作為DNA聚合酶活性的輔助因子，有助于聚合期間dNTP的結(jié)合。酶活性位點(diǎn)處的鎂離子可催化引物的3′-OH與dNTP的磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵。此外， Mg2+ 能夠穩(wěn)定磷酸鹽骨架上的負(fù)電荷，從而促進(jìn)引物與DNA模板形成復(fù)合物。緩沖液的一個(gè)常見成分是來自KCl的鉀離子，其可促進(jìn)引物的吸附。也可使用硫酸銨(NH4)2SO4 代替KCl。銨離子(NH4+) 具有去穩(wěn)定作用，尤其對(duì)于錯(cuò)配引物-模板復(fù)合物堿基對(duì)之間的弱氫鍵，因此可增強(qiáng)反應(yīng)特異性。

DNA聚合酶

DNA聚合酶是PCR的重要組成部分，它們能夠從單鏈DNA模板合成新的互補(bǔ)鏈。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即摻入核苷酸并使引物從按5'至3’方向延伸。

TaqDNA 聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌中分離出來的，Taq DNA 聚合酶具有極高的熱穩(wěn)定性，或許能夠承受 PCR 的熱變性步驟。Pfu DNA聚合酶是一種為大家所熟知的超耐熱酶，來自于水熱環(huán)境中的超嗜熱古細(xì)菌 Pyrococcus furiosus。在95°C下，Pfu聚合酶的穩(wěn)定性能比 Taq聚合酶高20倍。高保真DNA聚合酶：其校正活性基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正錯(cuò)誤插入的核苷酸。DNA聚合酶上的核酸外切酶活性位點(diǎn)與其5′→ 3′聚合酶活性位點(diǎn)是分離的。當(dāng)錯(cuò)配的核苷酸插入聚合結(jié)構(gòu)域，DNA合成將因不合適的堿基配對(duì)動(dòng)力學(xué)而暫停。暫停期間，DNA聚合酶將切除錯(cuò)配的核苷酸并用正確的核苷酸替換。

PCR實(shí)驗(yàn)操作

在進(jìn)行基因克隆或者載體構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)中我們使用高保真DNA聚合酶

按照說明書準(zhǔn)備高保真酶mix、DNA模板、引物、雙蒸水

查看引物單信息，核對(duì)引物濃度和Tm值

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